Informācija

Kādas ir problēmas, izmantojot ekspresijai ssDNS vai mRNS, nevis plazmīdu?


Pieņemsim, ka vēlaties veikt gēnu klonēšanas eksperimentu. Jums ir tukšs ekspresijas vektors (mRNS vai DNS) un jūs vēlaties tajā klonēt kādu gēnu X. Kāpēc jūs varat iegādāties X tikai jau vektorā (kas savukārt bieži atrodas baktēriju nesēja iekšpusē)?

Kāda ir problēma ar gēna X tīru mRNS nukleotīdu apstrādi? Vai pat sscDNA?


Kāda ir problēma ar gēna X tīru mRNS nukleotīdu apstrādi? Vai pat sscDNA?

Problēmas tieši transficējot mRNS/ssDNS

mRNS var tikt transficētas šūnās, un tas tiek darīts diezgan bieži. Problēma ar mRNS tiešu transfekciju ir tāda, ka mRNS drīz tiek sadalīta, un jums nebūs ilgstošas ​​ekspresijas. Tomēr tas ir ļoti noderīgi dažos gadījumos, piemēram, radot inducētas pleiripotentas cilmes šūnas (iPSC), ja nevēlaties, lai šūnas nepārtraukti izteiktu Yamanaka faktorus (daži no tiem ir arī onkogēni).

Arī RNS kā tādas ir diezgan jutīgas pret degradāciju. Ir daudz vieglāk sagatavot un ilgstoši uzglabāt DNS šķīdumus.

Līdzīgas problēmas rodas ar ssDNA.

Kāpēc jūs varat iegādāties X tikai jau vektorā (kas savukārt bieži atrodas baktēriju nesēja iekšpusē)?

Viena liela priekšrocība, lietojot plazmīdas, ir tā, ka jūs varat bezgalīgi izplatīt savu gēnu. Ja jums tā vietā tiktu dots noteikts daudzums mRNS, tad tas drīz beigsies. Daži pārdevēji piekopj tik mantkārīgu kapitālistisku politiku: P.

Ja jūs pastiprināt DNS, izmantojot PCR, tad klonēšanai ir papildu priekšrocības:

  • jūs varat sekvenēt gēnu, izmantojot labi standartizētus praimerus (piemēram, T7)
  • jūs varat izveidot konstrukcijas, kas nosacīti var izteikt gēnu

Jums ir tukšs ekspresijas vektors (mRNS vai DNS) un jūs vēlaties tajā klonēt kādu gēnu X.

Jūs nevarat viegli klonēt kaut ko RNS iekšienē. Jums ir nepieciešamas specifiskas RNS endonukleāzes. Turklāt dubultā gremošana šajā gadījumā būs postoša.

Kāpēc pārdevēji parasti nepārdod dsDNA ieliktni, bet gan nodrošina to klonētu plazmīdā

  • Apļveida dsDNS ir stabilāka
  • Pārdevēji var saglabāt ieliktņa krājumus nākamajiem klientiem, neveicot atkārtotu PCR
  • Klonētu ieliktni var pastiprināt, izmantojot baktēriju kultūras, lai iegūtu ļoti lielu daudzumu (maxi/giga preps)

Mājasdarbu problēmas - Literatūras apguves modulis: transkripcijas faktors Ikaros nomāc proteīna fosfatāzi 2A

  • Piedalījās Henrijs Jakubovskis
  • Benedikta koledžas profesors (ķīmija)/St. Jāņa universitāte

Šajā lapā ir vērtēšanas/eksāmenu jautājumi, izmantojot datus, skaitļus un grafikus no pētniecības žurnāliem, piemēram, Journal of Biological Chemistry, kas ļauj tos izmantot, vai no žurnāliem, piemēram, no PLOS, kuriem ir pilnīgi brīva piekļuve. Izvēlētie raksti un tēmas tika atlasītas, lai novērtētu studentu izpratne par Amerikas Bioķīmijas un molekulārās bioloģijas biedrības (ASBMB) pamatjēdzieniem un mācību mērķiem, kā arī MCAT2015 pamatjēdzieniem un mērķiem. Šie divi standartu komplekti lielā mērā pārklājas. Gan ASBMB, gan MCAT2015 ļoti uzsver zinātniskās izpētes un spriešanas prasmes, kuras, iespējams, vislabāk novērtē ar atvērtiem jautājumiem, kas iegūti no literatūras, kurā studentiem jāizmanto augstāka līmeņa Bloom pielietošanas un analīzes prasmes.

Šos jautājumus var izmantot arī studenti, kuri meklē vairāk iespēju praktizēt pētnieciskās literatūras rezultātu interpretāciju. Spēja pielietot, analizēt un novērtēt informāciju un koncepcijas ir zinātniskās izpētes un spriešanas prasmju pamatā, kas ir jauno ASBMB un MCAT2015 kompetences standartu centrā. Jautājumi šajā mācību modulī ir paredzēti šo kompetenču novērtēšanai, izmantojot atvērtās atbildes, nevis atbilžu variantus. Atbildes var atrast saitē šīs lapas apakšā.


Guide-it Long ssDNA Production System v2 ietver uzlabojumus, kas ļauj efektīvāk apstrādāt izaicinošās veidnes, nodrošina lielāku ssDNA iznākumu un ļauj vienkāršot protokolu salīdzinājumā ar mūsu pirmās paaudzes ssDNA komplektiem (kat. Nr. 632644, 632645).*

Uzlabota ssDNA ģenerēšana, izmantojot Guide-it Long ssDNA ražošanas sistēmu v2. Gēla attēls, kurā parādīts dsDNA izejmateriāls (1. josla) un sens (SS) vai antisense (AS) ssDNA produkti vairākām HDR veidnēm, kas ģenerētas, izmantojot sākotnējās (v1) vai atjauninātās (v2) versijas Guide-it Long ssDNA ražošanas sistēmā ( Attiecīgi 2. un 3. josla). šajā analīzē iekļautās dsDNA veidnes tika identificētas kā izaicinoši substrāti ssDNA ģenerēšanai, izmantojot v1 Guide-it komplektu. DsDNS un ssDNA tika analizēti, izmantojot agarozes gēla elektroforēzi, par krāsvielu izmantojot etīdija bromīdu. ssDNA produkti darbojas ar mazāku molekulmasu nekā atbilstošie dsDNS substrāti. Visos gadījumos Guide-it Long ssDNA Production System v2 ģenerēja tīrāku ssDNA joslu nekā iepriekšējā komplekta versija, kas liecina par pilnīgāku un vienmērīgāku gremošanu.

*Lūdzu, ņemiet vērā, ka, uzsākot Guide-it Long ssDNA Production System v2, sākotnējie Guide-it ssDNA komplekti (kat. Nr. 632644, 632645) vairs nav pieejami.

Papildu informācija par produktu

Lūdzu, skatiet produkta analīzes sertifikātu, lai iegūtu informāciju par uzglabāšanas apstākļiem, produkta sastāvdaļām un tehniskajām specifikācijām. Lūdzu, skatiet komplekta sastāvdaļu sarakstu, lai noteiktu komplekta sastāvdaļas. Analīzes sertifikāti un komplekta komponentu saraksti atrodas cilnē Dokumenti.


MMLV retrovīrusu gēnu ekspresijas vektors

MMLV retrovīrusu vektoru sistēma ir efektīvs līdzeklis gēnu pastāvīgai ievadīšanai zīdītāju šūnās. Tas kļuva īpaši populārs kā gēnu piegādes metode iPS šūnu izgatavošanai.

MMLV retrovīrusu vektori ir iegūti no Moloney peles leikēmijas vīrusa, kas ir retrovīrusu ģimenes loceklis. Savvaļas tipa MMLV vīrusam ir plus-line lineārs RNS genoms.

MMLV retrovīrusu vektors vispirms tiek konstruēts kā plazmīda E. coli. Pēc tam tas tiek transficēts iepakojuma šūnās kopā ar vairākām palīgplasmīdām. Iepakojuma šūnu iekšpusē vektora DNS, kas atrodas starp diviem gariem gala atkārtojumiem (LTR), tiek pārrakstīta RNS, un palīgplasmīdu ekspresētie vīrusu proteīni tālāk iesaiņo RNS vīrusā. Pēc tam dzīvs vīruss tiek izlaists supernatantā, ko var izmantot, lai inficētu mērķa šūnas tieši vai pēc koncentrācijas.

Kad vīruss tiek pievienots mērķa šūnām, RNS krava tiek pārvietota šūnās, kur tā tiek pārrakstīta DNS un nejauši integrēta saimnieka genomā. Jebkurš (-i) gēns (-i), kas vektoru klonēšanas laikā tika ievietots starp diviem LTR, pastāvīgi tiek ievietoti saimniekdatorā līdzās pārējam vīrusa genomam.

Pēc konstrukcijas MMLV retrovīrusu vektoriem trūkst gēnu, kas nepieciešami vīrusu iesaiņošanai un transdukcijai (šos gēnus nes palīgplasmīdas vai tā vietā tie ir integrēti iepakojuma šūnās). Tā rezultātā vīrusiem, kas ražoti no pārnēsātājiem, ir svarīga drošības iezīme, ka tie nav replikācijas spējas (tas nozīmē, ka tie var pārveidot mērķa šūnas, bet nevar tajās replicēties).

Lai iegūtu papildinformāciju par šo vektoru sistēmu, lūdzu, skatiet tālāk sniegtos dokumentus.

Atsauces Temats
Exp Hematol. 31: 1007 (2003) Pārskats
J Virol. 61: 1639 (1987) Paplašināts iepakojuma signāls palielina MMLV vektoru titru
Gene Ther. 7: 1063 (2000) MMLV vektoru tropisms ir atkarīgs no iepakojuma šūnu līnijām
Nat Protoc. 6: 346 (2011) MMLV vektoru tropisms ir atkarīgs no iepakojuma plazmīdām

Mūsu vektors ir optimizēts augsta kopiju skaita replikācijai E. coli, dzīvā vīrusa augsta titra iepakojumam, efektīvai vīrusu transdukcijai plašā šūnu diapazonā, efektīvai vektoru integrācijai saimnieka genomā un augsta līmeņa transgēna ekspresijai.

Vektora DNS pastāvīga integrācija: Parastās transfekcijas rezultātā DNS zudums laika gaitā izraisa gandrīz pilnībā pārejošu DNS ievadīšanu saimniekšūnās. Šī problēma ir īpaši pamanāma šūnās, kas ātri dalās. Turpretī retrovīrusu transdukcija var pastāvīgi piegādāt gēnus saimniekšūnās, pateicoties vīrusa vektora integrācijai saimnieka genomā.

Plašs tropisms: Mūsu iepakojuma sistēma pievieno VSV-G apvalka proteīnu vīrusa virsmai. Šim proteīnam ir plašs tropisms. Rezultātā var tikt pārveidotas no parasti lietotām zīdītāju sugām, piemēram, cilvēkiem, pelēm un žurkām. Turklāt daudzus šūnu veidus var pārveidot, lai gan mūsu vektoram ir grūtības pārnest nesadalošās šūnas (skat. Trūkumus zemāk).

Liela kravas telpa: Savvaļas tipa MMLV retrovīrusu genoms ir

8 kb. Mūsu vektorā aizņem sastāvdaļas, kas nepieciešamas vīrusu iesaiņošanai un transdukcijai

5,5 kb, lai pielāgotu lietotāja interesējošo DNS. Tā kā mūsu vektors ir paredzēts tikai ORF ievietošanai, šī kravas telpa ir pietiekama lielākajai daļai lietojumu.

Augsta līmeņa izteiksme: 5 'LTR satur spēcīgu visuresošu promotoru, kas veicina lietotāja interesējošā gēna augsta līmeņa izpausmi.

Gēnu piegādes relatīvā vienveidība: Parasti vīrusu transdukcija var pārnest vektorus šūnās salīdzinoši vienādi. Turpretī tradicionālā plazmīdu vektoru transfekcija var būt ļoti neviendabīga, un dažas šūnas saņem daudz kopiju, bet citas šūnas saņem maz kopiju vai tās nav.

Efektivitāte in vitro un in vivo: Lai gan mūsu vektoru galvenokārt izmanto kultivētu šūnu in vitro transdukcijai, to var izmantot arī šūnu pārveidošanai dzīviem dzīvniekiem.

Drošība: Mūsu vektora drošību nodrošina, sadalot gēnus, kas nepieciešami vīrusu iesaiņošanai un transdukcijai, vairākās palīgplasmīdās vai integrējot tos iepakojuma šūnās. Tā rezultātā dzīvs vīruss, kas ražots no mūsu vektora, nav spējīgs replikēties.

Trūkumi

Atkarība no 5 'LTR promotora: Interesējošā gēna ekspresiju mūsu vektorā virza visuresošā promotora funkcija 5 'LTR. Tas ir acīmredzams trūkums salīdzinājumā ar mūsu lentivīrusu vektoriem, kas ļauj lietotājam ievietot savu promotoru, lai virzītu viņu interesējošo gēnu.

Vidējs vīrusa titrs: Vīrusu titrs no mūsu vektora sasniedzamības

107 TU/ml iepakojuma šūnu supernatantā bez turpmākas koncentrācijas. Tas ir apmēram par pakāpi zemāks nekā mūsu lentivīrusu vektori.

Grūtības sadalīt nedalāmas šūnas: Mūsu vektoram ir grūtības pārnest nedalāmas šūnas.

Tehniskā sarežģītība: MMLV retrovīrusu vektoru izmantošanai ir nepieciešams ražot dzīvu vīrusu iepakojuma šūnās, kam seko vīrusa titra mērīšana. Šīs procedūras ir tehniski prasīgas un laikietilpīgas salīdzinājumā ar parasto plazmīdu transfekciju.

Galvenās sastāvdaļas

MMLV 5 'LTR: MMLV retrovīrusa 5 'garais termināla atkārtojums. Savvaļas tipa MMLV retrovīrusā 5 'LTR un 3' LTR pēc kārtas ir būtībā identiski. Tie atrodas divos vīrusa genoma galos un norāda vienā virzienā. Pēc vīrusu integrācijas 3 'LTR secība tiek kopēta uz 5' LTR. LTR ir gan promotora, gan poliadenilēšanas funkcija, tā ka 5 'LTR darbojas kā promotors, kas virza vīrusa genoma transkripciju, bet 3' LTR darbojas kā poliadenilācijas signāls, lai izbeigtu augšupējo transkriptu.

& Psi plus pack2: MMLV retrovīrusa iepakojuma signāls, kas nepieciešams vīrusa RNS iesaiņošanai vīrusā.

Kozaks: Kozak vienprātības secība. Tas ir novietots interesējošā ORF sākuma kodona priekšā, jo tiek uzskatīts, ka tas veicina tulkošanas uzsākšanu eikariotos.

ORF: Šeit ir ievietots jūsu interesējošā gēna atvērtais lasīšanas rāmis. Tās izteiksmi nosaka visuresošā promotora funkcija 5 'LTR.

MMLV 3 'LTR: MMLV retrovīrusa 3 'garais termināla atkārtojums. Poliadenilēšanas signāls, kas ietverts 3 'LTR, kalpo, lai izbeigtu transkripciju no augšupējā ORF.

pUC ori: pUC replikācijas izcelsme. Plazmas, kurām ir šī izcelsme, E. coli eksemplāros ir ļoti daudz.

Ampicilīns: Ampicilīna rezistences gēns. Tas ļauj saglabāt plazmīdu, atlasot ampicilīnu E. coli.


Dažas CFTR mutācijas var ārstēt bez RNS terapijas

Lielākā daļa gēnu mērķu atrodas kaut kur spektrā starp TTR, kas ir ideāls, un ģenētiski nestabilu vēzi, kas nav ideāls. Viens no šādiem piemēriem ir CF, slimība, ko izraisa autosomāli recesīvas mutācijas CFTR, kas atrodas 7. hromosomā (1.a att.). 21 Amerikas Savienotajās Valstīs aptuveni 1 no 2500 kaukāziešu bērniem tiek diagnosticēta slimība, un ievērojami mazāks sastopamības biežums tiek novērots gan afroamerikāņu, gan Āzijas populācijās. 22 Prognozes kopš slimības atklāšanas ir ievērojami uzlabojušās, bet joprojām ir daudz zemākas nekā cilvēkiem bez CF, vidējais paredzamais dzīves ilgums tagad pārsniedz 40 gadus, galvenokārt pateicoties ārstēšanai, kas ārstē bakteriālas infekcijas, aizvieto aizkuņģa dziedzera fermentus, uzlabo barības vielu uzsūkšanos un atvieglot biezu gļotu attīrīšanu no krūtīm 23,24

Tur ir daudz CFTR mutantu genotipus nesen, zinātnieki lēsa, ka vairāk nekā 1000 ģenētisko variāciju CFTR gēns ir pārstāvēts mazāk nekā pieciem pacientiem visā pasaulē. Tomēr šo mutāciju komplektu var grupēt tikai sešās klasēs, kuras atšķiras pēc ietekmes uz CFTR proteīnu un tā lejupvērsto fenotipu šūnā. 26 Dažas mutācijas šajās klasēs jau var ārstēt ar FDA apstiprinātām mazām molekulām. 25,26 Citas mutācijas nevar un tāpēc nākotnē var būt vairāk atkarīgas no RNS terapijas (2. att.).

2. attēls. CF mutācijas ietilpst sešās dažādās klasēs. Šīs klases svārstās no CFTR mRNS mutantu transkriptu ģenerēšanas, kas netiek tulkoti, līdz kļūdainu CFTR olbaltumvielu ģenerēšanai, kas neļauj pietiekami daudz jonu pārvietoties caur šūnu membrānu. Sešu klašu ārstēšanai tika izmantotas dažādas mazas molekulas, tostarp mazās molekulas, korektors un uz potenciācijas līdzekļiem balstītas terapijas. CFTR mutācijas, kuras, visticamāk, neatrisinās esošās mazās molekulas, var būt labāki kandidāti RNS gēnu terapijai.

I klases mutācijas, piemēram, G542X, W1282X vai R553X, izraisa priekšlaicīgu stopkodonu, kas neļauj izveidot funkcionālu proteīnu. 27,28 Lai ārstētu šāda veida mutācijas, zinātnieki ir izstrādājuši nelielas molekulas. Šīs mazās molekulas apiet priekšlaicīgus stopkodonus, lai veicinātu transkripciju. 26 Nelielas molekulas ir pārbaudītas vairākos pētījumos un klīniskajos pētījumos, tomēr nav zināms, vai tās apstiprinās FDA. Šo iespējamo mazmolekulāro zāļu trūkumu I klases mutāciju ārstēšanai var alternatīvi risināt ar mRNS terapiju, kas paredzēta trūkstošo aizstāšanai CFTR gēns.

II klases mutācijas rada nepareizi salocītus proteīnus, kas nespēj sasniegt šūnu membrānu. 26 Starp šīm mutācijām ir ievērojams ΔF508 variants: mutācija, ko izraisa trīs bāzes pāru dzēšana eksonā 10, kā rezultātā no CFTR proteīna nav fenilalanīna atlikuma. 30 Vairāk nekā 70% bojātu CFTR alēles ietver šo mutāciju, padarot to par galveno CF cēloni ASV. Rezultātā ir ieguldīts milzīgs daudzums pētījumu, lai atrastu ārstēšanu pacientiem ar ΔF508 mutāciju, kā rezultātā tika apstiprinātas mazo molekulu terapijas.

Piemēram, lumakaftora/ivakaftora kombinācija darbojas, lai daļēji atjaunotu CFTR funkciju. Konkrēti, lumakaftors ir CFTR korektors, kas palīdz olbaltumvielu locīšanas procesā, ļaujot CFTR transportēt uz šūnas virsmu. 31 Kad CFTR sasniedz šūnas virsmu, ivakaftors darbojas kā potenciātors, nodrošinot, ka CFTR ļauj iziet cauri hlorīda joniem. 32 Proti, ΔF508 gadījumā ivakaftors pats par sevi nav efektīvs, jo tam nepieciešams pareizi salocīts CFTR proteīns. 32,33

Ir izstrādāti arī nākamās paaudzes korektori, lai risinātu dažādas apstrādes novirzes, tostarp tezakaftoru un eleksakaftoru. Konkrētāk, eleksakaftors saistās ar citu CFTR proteīna kabatu un uzlabo plaušu darbību un citus ar elpošanu saistītus faktorus, ja to lieto kombinācijā ar tezakaftoru un ivakaftoru. 34 Faktiski FDA nesen apstiprināja Trikafta - trīskāršu kombinētu terapiju, kas apvieno eleksakaftoru, ivakaftoru un tezakaftoru. Trikafta ir apstiprināts lietošanai pacientiem ar vismaz vienu ΔF508 mutāciju, turpretī iepriekšējā atsevišķā vai kombinētā terapija ārstēja tikai pacientus, kas bija homozigoti attiecībā uz ΔF508 mutāciju. 35,36 Šīs mazmolekulārās procedūras iezīmē milzīgus panākumus CF zinātniekiem un pacientiem. Turpmākajām CF terapijām, ieskaitot mRNS terapiju, būs jāpierāda ārkārtīgi augsta drošība un efektivitāte, lai aizstātu šīs esošās zāles.

Citi novēroti CFTR mutācijas ietilpst III – VI klasē. III klases mutācijai trūkst funkcionālu jonu kanālu vārtu, IV klasei ir bojāta jonu vadītspēja visā CFTR kanālā, V klases rezultātā nepietiekams CFTR proteīns sasniedz šūnas virsmu, un VI klasei ir augsts CFTR apgrozījums zemu olbaltumvielu dēļ stabilitāte pie šūnu membrānas. 27 Ivacaftor, CFTR pastiprinātājs, ir apstiprinājusi FDA, lai ārstētu 38 variantus CFTR mutācijas, galvenokārt III klasē, bet interesanti, liecina par atšķirīgu uzlabošanās pakāpi atkarībā no pacienta genotipa. 25,37

Saistībā ar to ir daudz CFTR varianti, kas ir ārkārtīgi reti (dažreiz tikpat reti kā vienai personai). Tā rezultātā var būt grūti iegūt pietiekami spēcīgus klīniskos pierādījumus, lai pamatotu apstiprinājumu mazmolekulārām zālēm, atstājot šos pacientus neizpratnē. Pat ja ir klīniski pierādījumi, ka retu vai vēl pētāmu mutāciju var ārstēt ar esošu mazu molekulu, piekļuve šīm “ārpus marķējuma” zālēm var būt dārga, bloķējot pacientu piekļuvi. Ir saskaņoti centieni, lai vēl vairāk saprastu, kuras mutācijas ir ārstējamas ar esošajām mazo molekulu terapijām un kā tās atšķiras no neārstējamiem mutāciju variantiem. 25,27 Izpratne par šīm atšķirībām un izaicinājumiem, ko tās rada CF pacientiem, ir svarīga, lai identificētu mutācijas, kuras, iespējams, būs jārisina, izmantojot RNS terapiju.


Lietojumprogrammas

  • Vienpavediena DNS noārdīšanās
  • SsDNS fragmentu noņemšana reakcijas maisījumā
  • PCR primer gremošanas pēcreakcija

Piezīmes

Eksonukleāzi I nedrīkst izmantot, lai iztukšotu DNS galus. Īsi DNS gali nav piemērots eksonukleāzes I substrāts. DNS beigu iztukšošanai izmantojiet DNS polimerāzi I, Klenovas fragmentu (2140A, 2140AK, 2140B, 2140BK) vai Mung pupu nukleāzi (2420A, 2420B).

Buferis

Komplektā ar 1 ml 10X eksonukleāzes I buferšķīduma [670 mM glicīna-KOH, pH 9,5, 10 mM DTT, 67 mM MgCl2].

Papildu informācija par produktu

Lūdzu, skatiet produkta analīzes sertifikātu, lai iegūtu informāciju par uzglabāšanas apstākļiem, produkta sastāvdaļām un tehniskajām specifikācijām. Lūdzu, skatiet komplekta sastāvdaļu sarakstu, lai noteiktu komplekta sastāvdaļas. Analīzes sertifikāti un komplekta komponentu saraksti atrodas cilnē Dokumenti.

Takara Bio USA, Inc.
Amerikas Savienotās Valstis/Kanāda: +1.800.662.2566 & bull Asia Asia Pacific: +1.650.919.7300 & bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japāna: +81. (0) 77.565.6999
TIKAI PĒTNIECĪBAS LIETOŠANAI. NELIETOJUMS DIAGNOSTIKAS PROCEDŪRĀS. & kopēt 2021 Takara Bio Inc. Visas tiesības aizsargātas. Visas preču zīmes ir Takara Bio Inc. vai tās filiāļu (-u) ASV un/vai citās valstīs, vai to attiecīgo īpašnieku īpašums. Dažas preču zīmes var nebūt reģistrētas visās jurisdikcijās. Papildu informācija par produktu, intelektuālo īpašumu un ierobežotas izmantošanas informāciju ir pieejama vietnē takarabio.com.

Takara Bio Europe ir vadošā dzīvības zinātņu uzņēmuma Takara Bio Group biedrs, kurš ir apņēmies uzlabot cilvēka stāvokli, izmantojot biotehnoloģijas. Izmantojot mūsu zīmolus Takara, Clontech un Cellartis, mūsu misija ir izstrādāt augstas kvalitātes novatoriskus rīkus un pakalpojumus, lai paātrinātu atklāšanu.


Arber S, Han B, Mendelsohn M, Smith M, Jessell TM, Sockanathan S (1999) Prasība homeobox gēnam Hb9 mehānisko neironu identitātes konsolidācijā. Neirons 23 (4): 659–674

Bader M (2010) Sirds un asinsvadu slimību žurku modeļi. Metodes Mol Biol 597: 403–414

Brenner M, Kisseberth WC, Su Y, Besnard F, Messing A (1994) GFAP promotors vada astrocītu specifisko ekspresiju transgēnās pelēs. J Neurosci 14: 1030–1037

Brown AJ, Fisher DA, Kouranova E, McCoy A, Forbes K, Wu Y, Henry R, ​​Ji D, Chambers A, Warren J, Shu W, Weinstein E, Cui X (2013) Veselu žurku nosacītā gēna nokauts, izmantojot genoma rediģēšanu . Nat metodes 10: 638–640

Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M (2001) Kaulu smadzeņu stromas šūnu intravenozas ievadīšanas terapeitiskais ieguvums pēc smadzeņu išēmijas žurkām. Insults 32 (4): 1005–1011

Chou WC, Takeo M, Rabbani P, Hu H, Lee W, Chung YR, Carucci J, Overbeek P, Ito M (2013) Folikulāro melanocītu cilmes šūnu tieša migrācija uz epidermu pēc brūces vai UVB apstarošanas ir atkarīga no Mc1r signalizācijas. Nat Med 19 (7): 924–929

Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013) Multiplex genoma engineering, izmantojot CRISPR/Cas sistēmas. Zinātne 339: 819

Fan X, Petitt M, Gamboa M, Huang M, Dhal S, Druzin ML, Wu JC, Chen-Tsai Y, Nayak NR (2012) Pārejoša, inducējama, placentas specifiska gēnu ekspresija pelēm. Endokrinoloģija 153 (11): 5637–5644

Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, Metzger D, Chambon P (1996) Ligandu aktivizēta vietnei specifiska rekombinācija pelēm. Proc Natl Acad Sci USA 93: 10887–10890

Feil R, Wagner J, Metzger D, Chambon P (1997) Cre rekombināzes aktivitātes regulēšana ar mutētiem estrogēnu receptoru ligandu saistošiem domēniem. Biochem Biophys Res Commun 237: 752–757

Feil S, Valtcheva N, Feil R (2009) Inducible Cre pelēm. Protokols. Gēnu nokautēšanas protokoli, sērija 530 no molekulārās bioloģijas metodēm. 343. – 363. lpp

Flood DG, Lin YG, Lang DM, Trusko SP, Hirsch JD, Savage MJ, Scott RW, Howland DS (2007) Alcheimera slimības transgēns žurku modelis ar ārpusšūnu Abeta nogulsnēšanos. Neurobiol Aging 30 (7): 1078–1090

Franz WM, Mueller OJ, Fleischmann M et al (1999) 2,3 kb gludo muskuļu miozīna smagās ķēdes veicinātājs vada gēnu ekspresiju transgēnu peļu un trušu asinsvadu sistēmā. Cardiovasc Res 43: 1040–1048

Groth AC, Calos MP (2004) Fāgu integrāzes: bioloģija un pielietojums. J Mol Biol 335 (3): 667–678

Guenther C, Tasic B, Luo L, Bedell M, Kingsley D (2014) Molekulārs pamats klasiskai gaišai matu krāsai eiropiešiem. Nat Genet. https://doi.org/10.1038/ng.2991

Jinek M, East A, Cheng A, Lin S, Ma E, Doudna J (2013) RNS ieprogrammēta genoma rediģēšana cilvēka šūnās. eLife 2: e00471

Keravala A, Groth AC, Jarrahian S, Thyagarajan B, Hoyt JJ, Kirby PJ, Calos MP (2006) Serīna fāgu integrāžu daudzveidība nodrošina vietu specifisku rekombināciju zīdītāju šūnās. Mol Gen Genom 276: 135–146

Kobayashi T, Ebihara S, Ishii K, Kobayashi T, Nishijima M, Endo S, Takakub A, Sakagami H, Kondoe K, Tashirog F, Miyazakig J, Obata K, Tamura S, Yanagawa Y (2003) Peles strukturālais un funkcionālais raksturojums glutamāta dekarboksilāzes 67 gēna promotors. Biochem Biophys Acta 1628 (2003): 156–168

Lakso M, Sauer B, Mosinger J, Lee EJ, Manning RW, Yu SH, Mulder KL, Westphal H (1992) Mērķtiecīga onkogēna aktivizēšana ar vietnei specifisku rekombināciju transgēnās pelēs. PNAS 89: 6232–6236

Lange A, Gegg M, Burtscher GM, Bengel D, Kremmer E, Lickert H (2012) Fltp (T2AiCre): jauna piekļaujama peles līnija nosacītu gēnu mērķēšanai atsevišķos mono- un daudzslāņu audos. Diferenciācija 83 (2): S105 – S113. https://doi.org/10.1016/j.diff.2011.11.003

Lewandoski M (2001) Nosacīta gēnu ekspresijas kontrole pelē. Nat Rev Genet 2: 743–755

Li J, Ishii T, Feinstein P, Mombaerts P (2004) Smaržojošo receptoru gēnu izvēle tiek atiestatīta ar kodola pārnešanu no peles ožas maņu neironiem. Daba 428 (6981): 393–399

Lobe CG, Nagy A (1998) Nosacītas genoma izmaiņas pelēm. BioEssays 1998 (20): 200–208

Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013) RNS vadīta cilvēka genoma inženierija, izmantojot Cas9. Zinātne 39 (6121): 823–826. https://doi.org/10.1126/science.1232033

Meyer M, de Angelis MH, Wurst W, Kühn R (2010) Gēnu mērķēšana ar homologu rekombināciju peles zigotos, ko ietekmē cinka pirkstu nukleāzes. Proc Natl Acad Sci USA 107 (34): 15022–15026

Meyer M, Ortiz O, Hrabé de Angelis M, Wurst W, Kühn R (2012) Slimības mutāciju modelēšana, izmantojot gēnu mērķauditoriju vienas šūnas peles embrijos. Proc Natl Acad Sci USA 109 (24): 9354–9359

Minskaia E, Ryan MD (2013) Olbaltumvielu koekspresija, izmantojot FMDV2A: “saite” atlikumu ietekme. Biomed Res Int 2013: 291730. https://doi.org/10.1155/2013/291730

Nakano T, Windrem M, Zappavigna V, Goldman SA (2005) Konservēta 125 bāzes pāra Hb9 pastiprinātāja identifikācija, kas nosaka gēnu ekspresiju mugurkaula motoru neironiem. Dev Biol 283 (2): 474–485

Ohtsuki S, Kamiya N, Hori S, Terasaki T (2005) Asinsvadu endotēlija selektīvā gēna indukcija ar Tie2 promotoru/pastiprinātāju smadzenēs un transgēnas žurkas tīklenē. Pharm Res 22 (6): 852–857

Orban PC, Chui D, Marth JD (1992) Audu un vietas specifiska DNS rekombinācija transgēnās pelēs. Proc Natl Acad Sci ASV 89: 6861–6865

Overstreet DH (1993) The Flinders jutīgās līnijas žurkas: ģenētiskais dzīvnieku depresijas modelis. Neurosci Biobehav Rev 17 (1): 51–68

Rasiman G, Li Y (2007) Neironu ceļu remonts ar ožas apvalka šūnām. Nat Rev Neurosci 8 (4): 312–319

Rasmussen M, Kong L, Zhang GR, Liu M, Wang X, Szabo G, Curthoys NP, Geller AI (2007) Glutamatergic vai GABAergic neironiem specifiska, ilgstoša ekspresija neokortikālos neironos no palīgvīrusu nesaturošiem HSV-1 vektoriem fosfātu aktivēta glutamināze, vezikulārais glutamāta transporteris-1 vai glutamīnskābes dekarboksilāzes veicinātājs. Smadzeņu rez. 1144: 19–32

Ruan J, Li H, Xu K, Wu T, Wei J, Zhou R, Liu Z, Mu Y, Yang S, Ouyang H, Chen-Tsai RY, Li K (2015) Ļoti efektīvs CRISPR/Cas9 mediēts transgēna knockin plkst. H11 lokuss cūkām. Sci Rep 5: 14253. https://doi.org/10.1038/srep14253

Ryan MD, King AM, Thomas GP (1991) Mutes un nagu sērgas vīrusa poliproteīna šķelšanos veicina atliekas, kas atrodas 19 aminoskābju secībā. J Gen Virol 72: 2727–2732

Sasahara M, Fries JW, Raines EW, Gown AM, Westrum LE, Frosch MP, Bonthron DT, Ross R, Collins T (1991) PDGF B-ķēde centrālās nervu sistēmas neironos, hipofīzes aizmugurē un transgēnā modelī. Šūna 1: 217–227

Zauers B (1987) Cre-Lox vietnei raksturīgās rekombinācijas sistēmas funkcionālā izpausme raugā Saccharomyces cerevisia. Mol Cell Biol 7: 2087–2096

Sauer B, Henderson N (1988) Vietnei specifiska DNS rekombinācija zīdītāju šūnās ar bakteriofāga P1 Cre rekombināzi. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5166–5170

Schlaeger TM, Bartunkova S, Lawitts JA, Teichmann G, Risau W, Deutsch U, Sato TN (1997) Vienota asinsvadu-endotēlija šūnu specifiskā gēnu ekspresija gan embrionālās, gan pieaugušo transgēnās pelēs. Proc Natl Acad Sci USA 94 (7): 3058–3063

Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) Ceļvedis fluorescējošo proteīnu izvēlē. Nat metodes 2 (12): 905–909

Singh P, Schimenti JC, Bolcun-Filas E (2015) Peles ģenētiķa praktiskais ceļvedis CRISPR lietojumos. Ģenētika 199 (1): 1–15

Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, Gamboa M, Zong H, Chen-Tsai Y, Luo L (2011) Vietnei raksturīga integrāzes izraisīta transģenēze pelēm, izmantojot pronukleāro injekciju. Proc Natl Acad Sci USA 108 (19): 7902–7907

Tasic B, Miyamichi K, Hippenmeyer S, Dani VS, Zeng H, Joo W, Zong H, Chen-Tsai Y, Luo L (2012) MADM paplašinājumi (mozaīkas analīze ar dubultiem marķieriem) pelēm. PLoS ONE 7 (3): e33332. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033332

Vassalli A, Rotmans A, Feinšteins P, Zapotocky MP (2002) Minigene ožas spuldzē piešķir odorant receptoriem specifiskus aksonu norādījumus. Neirons 35: 681–695

Weber T, Schönig K, Tews B, Bartsch D (2011) Inducējamas gēnu manipulācijas transgēno žurku smadzeņu serotonīnerģiskajos neironos. PLoS ONE 6 (11): e28283

West AG, Gaszner M, Felsenfeld G (2002) Izolatori: daudzas funkcijas, daudzi mehānismi. Gēni Dev 16 (3): 271–288

Witten IB, Steinberg EE, Lee SY, Davidson TJ, Zalocusky KA, Brodsky M, Yizhar O, Cho SL, Gong S, Ramakrishnan C, Stuber GD, Tye KM, Janak PH, Deisseroth K (2011) Rekombināzes vadītāju žurku līnijas: instrumentus, paņēmienus un optoģenētisko pielietojumu dopamīna mediētā pastiprināšanā. Neirons 72 (5): 721–733

Yang X, Arber S, William C, Li L, Tanabe Y, Jessell TM, Birchmeier C, Burden SJ (2001) Muskuļu acetilholīna receptoru gēnu ekspresijas veidošana bez motora inervācijas. Neirons 30 (2): 399–410

Young JI et al (1998) Pro-opiomelanokortīna genoma fragmentu autentiska, šūnām specifiska un attīstībā regulēta ekspresija transgēnu peļu hipotalāmu un aizmugurējo smadzeņu neironos. J Neurosci 18: 6631–6640

Zhang J, Zhang L, Jiao H, Zhang Q, Zhang D, Lou D, Katz JL, Xu M (2006) C-Fox atvieglo kokaīna izraisītu noturīgu izmaiņu iegūšanu un izzušanu. J Neurosci 26 (51): 13287-13296

Zhu F, Gamboa M, Farruggio AP, Hippenmeyer S, Tasic B, Shule B, Chen-Tsai Y, Calos MP (2013) Dice, efektīva sistēma atkārtotai genoma rediģēšanai cilvēka pluripotentās cilmes šūnās. Nukleīnskābes rez. 42 (5): e34. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1290


Tehnoloģiju attīstība

Mūsu laboratorija ir ieinteresēta jaunu ģenētisko tehnoloģiju izstrādē ar gēnu atklāšanas un cilvēku veselības pielietojumu. Dažas tehnoloģijas, kuras mēs šobrīd pētām, ir ģenētiskā skrīnings ar RNAI un ORF bibliotēkām, autoantivielu atklāšana un jaunas metodes antivielu atklāšanai. Pašlaik mūs īpaši interesē autoimūnās slimības un vakcīnu dizains. Daži no mūsu darbiem ir sīki aprakstīti zemāk.

ShRNA bibliotēkas

We kopā ar mūsu līdzstrādniekiem Grega Hannona laboratorijā ir izveidojuši lielas shRNS bibliotēkas, kas aptver visu cilvēka un peles genomu (171, 183). Bibliotēkas ir veidotas, izmantojot shRNS prognozēšanas algoritmus, un tiek sintezētas masveidā paralēli, izmantojot Agilent mikrouzņēmumus. Oligonukleotīdus pastiprina ar PCR un klonē retrovīrusu vai lentivīrusu vektoros. Šajā brīdī tos var izmantot vai nu tieši, vai pārbaudīt un secīgi apkopot. Katram vektoram ir arī unikāls svītrkods, kas saistīts ar baseinu mikroshēmu dekonvolūciju. Tādā veidā mēs varam ģenerēt lielas shRNS bibliotēkas ģenētiskai skrīningam (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Tehnoloģiju izstrāde).

Jauni shRNA vektori, PRIME vektori

TRNSi parādīšanās ir radījusi spēju traucēt gēnu ekspresiju un ievērojami paplašinājusi mūsu spēju veikt ģenētiskos ekrānus zīdītāju šūnās. Īsas matadata RNS ekspresiju no polimerāzes III promotoriem var kodēt transgēnos un izmantot, lai ražotu siRNS, kas pazemina specifiskus gēnus. Tomēr mēs atklājām, ka polimerāzes II transkribētās shRNS demonstrē ļoti efektīvu gēnu ekspresijas iznīcināšanu, kad shRNS ir iestrādāta mikro-RNS kontekstā (182). Svarīgi ir tas, ka mūsu shRNS ekspresijas sistēma (saukta par PRIME vektoriem) ļauj reportiera gēna daudzcistronisku koptranskripciju, tādējādi atvieglojot shRNS ražošanas izsekošanu atsevišķās šūnās. Pamatojoties uz šo sistēmu, mēs izstrādājām virkni lentivīrusu vektoru, kas vienā eksemplārā parāda uz tetraciklīnu reaģējošu gēnu ekspresijas iznīcināšanu. Šo PRIME vektoru lielā caurlaidība atvieglos funkciju ekrānu zaudēšanu visā genomā un ir svarīgs solis, lai izmantotu svītrkoda stratēģijas, lai sekotu specifisku secību zudumam sarežģītās populācijās.

Mēs esam arī izstrādājuši virkni PRIME vektoru, kas parāda labāku peles ES šūnu un citu šūnu notriekšanu, kur CMV promotors var nebūt optimāls. Turklāt mēs esam izstrādājuši vairāk uz tet reaģējošus inducējamus vektorus, kas kodē savu reverso tet-aktivatoru.

Rekombinantās DNS tehnoloģijas

MAGIC: In vivo ģenētiska metode ātrai rekombinantās DNS veidošanai

We izstrādāja jaunu, ļoti inženierijas in vivo klonēšanas metode, MAGIC (ģenētiski integrēta pārošanās palīdzība), kas veicina ātru rekombinantās DNS molekulu veidošanos (180). MAGIC izmanto baktēriju pārošanos, in vivo vietnei specifiska endonukleāzes šķelšanās un homologa rekombinācija, lai katalizētu DNS fragmentu pārnešanu starp donora vektoru vienā baktēriju celmā un saņēmēja plazmīdu atsevišķā baktēriju celmā. Rekombinācijas notikumi ir ģenētiski atlasīti, un rezultātā interesējošais gēns tiek pakļauts jaunu regulatīvo elementu kontrolei ar augstu efektivitāti. MAGIC novērš nepieciešamību pēc restrikcijas fermentiem, DNS ligāzēm, DNS sagatavošanas un visa in vitro manipulācijas, kas nepieciešamas subklonēšanai, un ļauj ātri izveidot vairākas konstrukcijas ar minimālu piepūli. Mēs parādām, ka MAGIC var radīt konstrukcijas ekspresijai vairākos organismos. As this new method requires only the simple mixing of bacterial strains, it represents a significant advance in high throughput recombinant DNA production that will save researchers significant amounts of time, effort and expense in functional genomics studies.

SLIC Cloning: a method for subcloning without restriction enzymes or DNA ligase

We developed a novel cloning method SLIC (Sequence and Ligation-Independent Cloning) that allows the assembly of multiple DNA fragments in a single reaction using in vitro homologous recombination and single-strand annealing (195). SLIC mimics in vivo homologous recombination by relying on exonuclease generation of single strand DNA (ssDNA) overhangs on insert and vector fragments and the assembly of these fragments by recombination in vitro. SLIC inserts can be prepared by incomplete PCR (iPCR) or mixed PCR. SLIC allows efficient and reproducible assembly of recombinant DNA with as many as 5 and 10 fragments simultaneously. SLIC circumvents the sequence requirements of traditional methods and is much more sensitive when combined with RecA to catalyze homologous recombination. It also provides a new method for site-directed mutagenesis of a gene. This flexibility allows much greater versatility in the generation of recombinant DNA for the purposes of synthetic biology.

Enhanced display technologies for biomarker discovery – PhIP Seq

The sensitive detection of circulating biomarkers represents a powerful approach to screening for early malignancy. However, current techniques are limited in their ability to distinguish normal from pathological states. This work aims to improve on current screening technology, utilizing novel principles in synthetic biology. In particular, we combine next generation DNA sequencing with the display of polypeptide libraries encoded by microarray-derived oligonucleotides. Using the T7 bacteriophage system, we are able to display the complete human peptidome and thereby seek to discover autoantigen biomarkers common to breast cancer patients. In parallel we are developing a fully defined, synthetic human single chain variable fragment (scFv) antibody library. This library will be used in ribosome display format for a scFv library-versus-peptide library screen in an effort to create a proteomic scale scFv set. Our hope is that development of these technologies will facilitate the identification of circulating cancer biomarkers, thereby enabling early diagnosis and treatment of the disease.

The pINDUCER lentiviral toolkit for inducible RNA interference in vitro and in vivo.

The discovery of RNAi has revolutionized loss-of-function genetic studies in mammalian systems. However, significant challenges still remain to fully exploit RNAi for mammalian genetics. For instance, genetic screens and in vivo studies could be broadly improved by methods that allow inducible and uniform gene expression control. To achieve this, we built the lentiviral pINDUCER series of expression vehicles for inducible RNAi in vivo. Using a multicistronic design, pINDUCER vehicles enable tracking of viral transduction and shRNA or cDNA induction in a broad spectrum of mammalian cell types in vivo. They achieve this uniform temporal, dose-dependent, and reversible control of gene expression across heterogenous cell populations via fluorescence-based quantification of reverse tet-transactivator expression. This feature allows isolation of cell populations that exhibit a potent, inducible target knockdown in vitro and in vivo that can be used in human xenotransplantation models to examine cancer drug targets.

OLDER TECHNOLOGIES

Lambda YES cDNA Expression System

We have developed a multifunctional lambda expression vector system, lambda YES, designed to facilitate gene isolation from eukaryotes by complementation of E. coli and S. cerevisiae mutations (23). Lambda YES vectors have a selection for cDNA inserts using an oligo adaptor strategy and are capable of expressing genes in both E. coli and S. cerevisiae. They also allow conversion from phage l to plasmid clones using the cre-lox site-specific recombination system, referred to as automatic subcloning. Lambda YES vectors utilize an adaptor selection for inserts and can generate libraries with 109 recombinants per mg of cDNA insert. cDNA libraries constructed in these vectors have been used to isolate genes from humans by complementation of yeast. Using this technology we isolated the human Cdk2 gene (24) by complementation of a yeast cdc28 Ts mutation and the Cyclin F gene (40) as a suppressor of cdc4 Ts mutations which led to the discovery of F-box proteins (77).

UPS – the Univector Plasmid Fusion System: A method for rapid construction of recombinant DNA molecules without restriction enzymes

Modern biological research is highly dependent upon recombinant DNA technology. The functional analysis of a single gene requires the introduction of that gene into multiple vectors for different purposes. Conventional cloning methods are time-consuming and individual cloning events must be performed independently. To approach solving this problem, we sought to develop a systematic and uniform method with which to manipulate large sets of genes.

We developed a series of novel cloning methods that facilitate the rapid and systematic construction of recombinant DNA molecules (102). The central method is named the Univector Plasmid-fusion System (UPS). UPS employs cre-lox site-specific recombination to catalyze plasmid fusion between the Univector, a plasmid containing the gene of interest, and host vectors containing regulatory information. Fusion events are genetically selected and result in placement of the gene under the control of novel regulatory elements. A second UPS-related method allows for the precise transfer of coding sequences only from the Univector into a host vector. UPS eliminates the need for restriction enzymes, DNA ligases, and many in vitro manipulations required for subcloning and allows the rapid construction of multiple constructs for expression in multiple organisms. We demonstrate that UPS can be used to transfer whole libraries into new vectors. New methods for directional cloning of PCR fragments and for the generation of epitope tags and other fusions at the 3′ end of genes using homologous recombination in E. coli are described that facilitate cloning and manipulation of genes in the Univector.

Together, these recombination-based cloning methods constitute a new comprehensive approach for the rapid and efficient generation of recombinant DNA that can be used for parallel processing of large gene sets, an ability required for future genomic analysis. We are continuing to develop large-scale capabilities using UPS as an alternative to the expensive and limited GATEWAY system.

Advances in the Two-Hybrid System

The two-hybrid cloning system is a powerful genetic method to identify genes via protein-protein interactions. We have made a number of improvements to this method which are designed to increase the number of potential protein-protein interactions detectable and to streamline the labor intensive process of authenticating clones identified in the primary screen. The first improvement was the design of genetic selections instead of screens to detect interacting proteins (32, 39). We developed the strain Y190 using HIS3 as a reporter and Y166 which employed a URA3 reporter for this purpose. A selection vastly increases the numbers of library clones that can be searched and is now built into all systems. Secondly, through the use of negative selections for plasmid loss coupled with a replica-mating strategy, we have developed a rapid method to distinguish between the genuinely interacting clones and the nonspecific background that is inherent to the system. Third, a lambda phage vector, lambda ACT2, was made that allows construction of highly complex, HA epitope-tagged, directional libraries of GAL4 activation domain-fused cDNAs that can be converted to plasmid form by in vivo cre-lox mediated site-specific recombination. We also introduced yeast mating of library clones to baits as a rapid way to both generate libraries and well as to counter screen against false positives. These methods have been incorporated into all current two-hybrid system kits. We used these methods to identify the human p21 and p57 Cdk inhibitors.

A Cytoplasmic Two Hybrid System, The SOS Recruitment System

Esn collaboration with Michael Karin’s lab, we have developed a novel two hybrid system for the cloning of genes involved in protein-protein interactions (84). This system, called the SOS Recruitment System, SRS, relies on the activation of the ras signalling pathway when a fusion protein to the ras guanine nucleotide exchange factor, SOS, is recruited to the inner surface of the plasma membrane by physical association with a second protein targeted to the same membrane by a myristylation sequence. When SOS is successfully recruited to the plasma membrane, it activates ras and bypasses the need for the endogenous exchange factor, Cdc25, an essential protein. This system allows protein-protein interactions to be detected in the cytoplasm. Furthermore, proteins that activate transcription can be used in this system giving it an advantage over the transcriptionally based two-hybrid system. We have developed a lambda-based expression vector, lambda MS-TRP for expression of myristylation-fused cDNA libraries an other useful vectors for this method. Visit our protocols page for more information


Secinājumi

In summary, a CRISPR/Cas9 toolbox was developed for efficient and comprehensive engineering of the industrial workhorse C. glutamicum. Markerless gene deletion, gene insertion, single-nucleotide editing and double-locus editing were achieved by using a customized two-plasmid-based CRISPR/Cas9 system and a simplified co-transformation strategy. This toolbox works well in several C. glutamicum strains and holds promise for renovating the genome editing of corynebacteria.


“Hacking the software of life”: Salesmanship versus cranks

It might be a bit harsh of me to say that the “mRNA vaccines are gene therapy” narrative by antivaxxers is a self-inflicted wound. However, it is not at all harsh to point out how Moderna scientists and executives selling their technology provided antivaxxers with language that they could easily weaponize against COVID-19 vaccines. In particular, Mercola makes a lot of this 2017 talk by Dr. Tal Zaks, chief medical officer of Moderna, in which he likened mRNA vaccines to “hacking the software of life”:

It gets worse, though, and Mercola gleefully takes advantage of Moderna’s loose analogies:

Zaks’ analogy to a prowler doesn’t even make a lot of sense biologically or as an analogy. He seems to be likening the RNA from a vaccine to being a “prowler” compared to the “prowler” of the virus outside of the cell. It’s no wonder that antivaxxers can so easily turn such language against COVID-19 vaccines, as it Zaks seems to be implying that the body is more alarmed by RNA in its cells than it is from foreign protein circulating in the body. As for “information therapy”, my only thought reading that dates back to the early 1980s: Gag me with a spoon.

Seriously, I wish Moderna would lose this particular analogy. It’s done (and continues to do) so much harm. I understand why it is attractive to view mRNA as “software”, but in reality it’s not. If you really wanted to pursue the analogy, I’d say that DNA is the software, mRNA is the compilation of that software, and the protein is the output, but even that’s a strained analogy. However you look at that analogy, though, it allows Mercola to pull off a favorite old antivaccine trope, one that was resurrected for COVID-19 vaccines, namely that vaccines are “transhumanism“, a claim by antivaxxers that I first noticed in 2012.

Seriously, look at Mercola run with this:

And, of course, according to Mercola, transhumanism due to COVID-19 vaccines is part and parcel of the “Great Reset”, a conspiracy theory claiming that the pandemic was engineered by the global elites to allow for a “reset” in which they take control of the world economy. I can’t help but note that “the Great Reset” is another example of how poorly chosen words basically give conspiracy theorists a gift. “The Great Reset” really is a plan first proposed by the World Economic Forum exploring how countries might recover from the COVID-19 pandemic. I mean, seriously? Who thought of this term? Who at Moderna thought it would be a good idea to present their treatments as “hacking the software of life”, given all the negative connotations of hacking?

Again, words matter. While I can’t be too hard on Moderna for being cautious in its SEC filing and using language that reflected regulatory uncertainties of the time, I can blame Tal Zaks and the leadership of Moderna for using such easily weaponized analogies, such as “hacking the software of life” to sell its product to investors. I can blame the World Economic Forum for coming up with a term like the “Great Reset”. These words matter, and these words have been a gift to COVID-19 conspiracy theorists and a burden to those trying to counter disinformation.